Linus Pauling[1] ya había ganado el premio Nobel de Química cuando Émile Zuckerkandl se le acercó, en actitud reverente pero decidida, a proponerle un proyecto de investigación sobre la hemocianina y otras enzimas en que había presencia de cationes metálicos. Corría el año 1958, Pauling había acudido a una reunión en París y Zuckerkandl utilizó a conciencia sus dotes de persuasión en aquel encuentro con el prohombre.
Viaje a California
Un año más tarde Zuckerkandl se instalaba en California dispuesto ilusionadamente a trabajar en su proyecto, pero las cosas se torcieron enseguida. Pocos días más tarde andaba rumiando su decepción. Inesperadamente, Pauling había decidido un cambio de rumbo radical. Iban a investigar sobre secuenciación de proteínas.
Para Zuckerkandl el cambio suponía el abandono de sus expectativas. Para Pauling tenía mucho más sentido. Había recibido el premio Nobel de Química en 1954
“por su investigación sobre la naturaleza del enlace químico y su aplicación a la elucidación de la estructura de substancias complejas”[2]
y había sido pionero en extraer consecuencias de la revolución de la Física de principios del siglo XX en relación con el enlace químico[3], como atestiguaba su descubrimiento de la estructura en alfa-hélice de las proteínas. Seguramente nadie sabía más que él sobre la estructura de las proteínas.
Del análisis de proteínas a la Evolución Molecular
Zuckerkandl, contrariado, tuvo que confiar en que saliera algo bueno del nuevo proyecto, al cual se incorporó Richard Jones, un doctorando de Pauling. Su tarea era obtener la secuencia de aminoácidos de las cadenas polipeptídicas de hemoglobina[4] de distintos organismos. Básicamente, debían hacer la digestión enzimática de las proteínas y analizar los productos resultantes mediante técnicas de electroforesis y cromatografía.
No tardaron en descubrir algo muy interesante. Las secuencias de las cadenas peptídicas de la hemoglobina de distintos organismos mostraban variaciones. Eran parecidas, pero no iguales. Cada especie tenía su propia versión de la proteína. Las mismas cadenas peptídicas de animales cercanos en la clasificación mostraban una secuencia de aminoácidos casi idéntica, mientras que al comparar secuencias de aminoácidos de las cadenas peptídicas de organismos distantes las diferencias aumentaban.
“Por ejemplo, comparando una de las cadenas proteicas de las moléculas de hemoglobina, Pauling y Zuckerkandl constataron que, del total de sus ciento cuarenta y un aminoácidos, entre la versión humana y la del chimpancé solo había un aminoácido de diferencia, pero que entre la de los humanos y la de los caballos la diferencia era de 18 aminoácidos”[5].
En 1960, Pauling, Jones y Zuckerkandl publicaron que las variaciones en la secuencia de aminoácidos de las mismas proteínas en distintos organismos permitían determinar su grado de parentesco y construir árboles filogenéticos.[6]
A tenor de los resultados, la decisión de Pauling fue sin duda un acierto. Publicaron los primeros árboles filogenéticos de la Biología Molecular y fundaron la rama de la Biología que conocemos hoy día como Evolución Molecular.
Mutaciones
Por entonces ya era bien conocida la existencia de mutaciones. Las mutaciones son alteraciones del material genético, (ADN o ácido desoxirribonucleico) o de su proceso de duplicación y reparto en la formación de los gametos.
Hay mutaciones cariotípicas, en que las células germinales acaban con una o más dotaciones cariotípicas extraordinarias. Las células resultantes tienen, (en vez de dos juegos completos de cromosomas, uno de la madre y otro del padre en el caso humano), tres o más juegos completos de cromosomas. Este tipo de mutaciones hace inviable el proceso reproductivo en animales, pero en vegetales, a veces, da lugar a organismos funcionales.[7]
Las mutaciones cromosómicas se deben a errores en los procesos asociados a la formación de los gametos cuando hay un reparto incorrecto de fragmentos cromosómicos o, en algunos casos, de cromosomas enteros. Afectan a cientos de genes, que acaban ubicados incorrectamente. Según la importancia de las alteraciones, los cigotos alterados dan lugar a embriones viables o inviables.
Las mutaciones puntuales son pequeños cambios en la molécula de ADN. Son, con mucha diferencia, las más abundantes. Son las principales responsables de la diversidad genética.
Una lluvia fina
Las mutaciones cariotípicas y cromosómicas ocurren durante el proceso de formación de gametos, están relacionadas con el ciclo celular.
En cambio, las mutaciones puntuales son efecto del impacto de las radiaciones, como los rayos ultravioleta y los rayos X, o de la acción de algunas substancias químicas. Las causas son ambientales. Se producen mutaciones puntuales constantemente.
Sin embargo, es difícil conocer su frecuencia, ya que la mayoría no producen efectos perceptibles en los organismos. Como afectan a uno o pocos nucleótidos[8], incluso cuando tienen consecuencias directas son difíciles de detectar. Se calcula que, debido a nuevas mutaciones puntuales, de cada millón de gametos 28 provocan el albinismo; 30, la hemofilia; y 60, el enanismo acondroplásico.
Es interesante recordar que Zuckerkandl y Pauling analizaban variaciones en la secuencia de aminoácidos de las cadenas polipeptídicas de hemoglobina de animales.
La estructura del ADN había sido descubierta por Watson y Crick en 1953 y aún no había técnicas de secuenciación de ADN disponibles. Se sabía, eso sí, que las mutaciones en el ADN daban lugar a alteraciones en la secuencia peptídica. Los cambios en la secuencia peptídica eran un buen indicador de la existencia de mutaciones, aunque el camino era más complicado de lo que solía imaginarse en la época
El caso más sencillo
Supongamos que una pequeña población se halla constituida por individuos genéticamente idénticos. Y que a continuación una catástrofe geológica divide instantáneamente la población en dos, que quedan separadas e incomunicadas en dos islotes.
Resulta que un minuto más tarde todos los individuos ya no son genéticamente iguales. Algunos individuos de una y otra población han sufrido mutaciones en su genoma. Mutaciones distintas en cada caso, salvo increíble coincidencia. En su gran mayoría, mutaciones puntuales. Esto ocurre en ambos islotes. En poco tiempo, casi todos seguirán siendo muy parecidos, pero ya no idénticos. Supongamos ahora que las dos poblaciones continúan viviendo y reproduciéndose independientemente, cada cual en su islote.
Las mutaciones puntuales son alteraciones del material genético y la causa principal de la variedad genética. Dado que se producen al azar y que el número de mutaciones distintas es a efectos prácticos casi infinito, los organismos de cada islote van acumulando mutaciones en su material genético según va pasando el tiempo. A más tiempo transcurrido, mayor número de mutaciones acumuladas y, por tanto, mayor distancia genética entre las dos poblaciones.
En animales de reproducción sexual, la secuencia de acontecimientos puede resumirse así:
- Una población está formada por individuos. Cada uno de ellos sufre mutaciones al azar.
- Las mutaciones en el ADN de las células somáticas se pierden cuando muere el individuo.
- Algunas mutaciones se producen en el ADN de las células germinales y tienen posibilidades de pasar a la descendencia[9].
- Las poblaciones quedan sometidas a la selección natural.
- Con el paso del tiempo muchas mutaciones de células germinales se extienden en la población descendiente.
- Los conjuntos de mutaciones de ambas poblaciones divergen a lo largo del tiempo. Cuanto más tiempo pase, mayor será su diferencia genética. [10]
- Al cabo de mucho tiempo, las dos poblaciones pueden llegar a ser genéticamente muy diferentes, incluso a constituir especies distintas.[11]
- Las mutaciones en el material genético dan lugar a cambios en la secuencia peptídica de las proteínas. En consecuencia, las proteínas de las dos poblaciones van siendo progresivamente más y más distintas.
- La comparación de las secuencias peptídicas de las mismas proteínas[12] en especies distintas resulta ser un buen indicador de su distancia filogenética.
El reloj evolutivo molecular
La idea estaba en el aire. A principios de 1961, Pauling y Zuckerkandl anticiparon la posibilidad de emplear las proteínas como relojes moleculares de la evolución. Según Lewin:
“… . Por tanto, la noción de reloj evolutivo molecular se formuló a principios de 1961, aunque no se explicó formalmente hasta 1965, en un artículo de Zuckerkandl y Pauling.”[13]
Si las proteínas incrementan sus diferencias de forma constante a lo largo del tiempo, ¿podría calcularse la relación entre los cambios en las proteínas y el tiempo transcurrido? ¿Y cómo?
La primera pregunta merece una respuesta afirmativa. La respuesta a la segunda pregunta ha sido toda la serie de mejoras que han facilitado su incorporación en muchas investigaciones. Porque el reloj evolutivo molecular fue desde el principio una buena idea necesitada de concreción y asombrosamente rica en matices y sorpresas.
En su formulación más escueta, la hipótesis del reloj evolutivo molecular afirma que la sustitución de aminoácidos en moléculas de proteína ocurre aproximadamente con regularidad en relación con el tiempo.
En consecuencia, la medida de la cantidad de péptidos distintos en cadenas peptídicas equivalentes de diversos organismos es proporcional al tiempo transcurrido desde su separación de un antecesor común. Medir el cambio es también medir tiempo.
Dada su naturaleza estocástica, la medida de las diferencias en la secuencia[14] en cadenas peptídicas equivalentes adolece de cierto grado de imprecisión, pero ofrece las bases para construir el reloj.
No tan simple
Un reloj sirve para medir el tiempo, y un reloj molecular debe ser, por tanto, un instrumento capaz de medir el tiempo mediante el uso inteligente de las propiedades de algunas moléculas. En un artículo publicado en 1985, Sibley y Ahlquist recuerdan que:
«Emile Zuckerkandl y Linus Pauling, a la sazón en el Instituto de Tecnología de California, propusieron en 1962 que las proteínas evolucionaban a velocidad constante; desde entonces mucho se ha discutido y debatido acerca de los «relojes moleculares».»[15]
El reloj evolutivo molecular de Zuckerkandl y Pauling suscitó infinidad de trabajos, comprobaciones, debates y críticas a menudo bien fundadas. A continuación, se citan algunas de ellas:
- No era un verdadero reloj, sino solamente una herramienta capaz de ordenar eventos en el tiempo, sin unidades definidas. No permitía medir el tiempo en años. Necesitaba una calibración para ser eficaz como reloj.
- La regularidad en la sustitución peptídica no era tan buena como prometía. Se detectaron grandes diferencias en las tasas de sustitución de aminoácidos en diferentes proteínas e incluso entre linajes.
- Algunas de sus primeras aplicaciones concretas dieron resultados difíciles de creer o incompatibles con hechos conocidos.
- Se consideró la posibilidad de que el proceso de selección natural interfiriera en las tasas de sustitución.
- Daba preeminencia a las mutaciones puntuales y concedía escasa importancia a las alteraciones genéticas relacionadas directamente con el ciclo celular, contra la opinión más generalizada.
- Dio lugar a la aparición de la teoría neutralista de Motoo Kimura[16], quien afirmó que la mayoría de las mutaciones son neutras y por tanto indetectables para la selección natural. El neutralismo de Kimura desencadenó una notable polémica y obligó a reconsiderar aspectos importantes de la teoría evolutiva.
- Hizo notar la importancia de las llamadas “mutaciones silenciosas”.
- Abrió el camino a relojes de ADN bacteriano, mitocondrial y nuclear y de ARN.
Cada uno de estos apartados, que no agotan la lista, merece por sí mismo un estudio aparte.
Un reloj para el futuro
El reloj evolutivo molecular persiste. A más de sesenta años de su formulación, Ha dado lugar a cientos de publicaciones. Ha sido calibrado, reconsiderado, enriquecido y matizado. Ha sido necesario aprender a utilizarlo eficientemente, minimizando sus inconvenientes y aprovechando sus mejores cualidades. Hoy día es una herramienta imprescindible en el estudio de la evolución y proporciona estimaciones fiables, aptas para ser comparadas con las obtenidas por otros procedimientos, que no es poca cosa.
Además, sigue proporcionando resultados que ayudan a ubicar y entender cuestiones evolutivas que van desde la bioquímica comparada hasta los procesos macroevolutivos, cuestionando sobreentendidos y a veces promoviendo novedosos debates. Signo todo ello de su excelente salud.
Zuckerkandl puede sentirse satisfecho de aquel involuntario cambio de rumbo.
© Sensio Carratalà Beguer
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Ayala, Francisco J. «Vagaries of the molecular clock.» Proceedings of the National Academy of Sciences 94.15 (1997): 7776-7783.
J. D. Watson, A. Berry. ADN el secreto de la vida. 2003. Taurus.
Kimura, Motoo. «Molecular evolutionary clock and the neutral theory.» Journal of molecular evolution 26.1 (1987): 24-33.
Zuckerkandl, E. y Pauling, L., 1965. Evolutionary divergence and convergence in proteins. En: V. Bryson y Vogel H.J., eds. Evolving genes and proteins. New York: Academic Press. Pp. 97-166.
NOTAS
[1] Nacido en 1901, considerado el mejor químico de su generación, sus estudios sobre el enlace químico y la estructura alfa-hélice de las proteínas le hicieron acreedor al Premio Nobel de Química en 1954. Además, recibió el Premio Nobel de la Paz en 1961.
Fue presentado por J. D. Watson como el temible enemigo a batir en la carrera por dilucidar la estructura del ADN. Watson y Crick se sirvieron del libro “The Nature of the Chemical Bond” del propio Pauling para ganarle.
[2] https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/1954/pauling/facts/
Prize motivation: “for his research into the nature of the chemical bond and its application to the elucidation of the structure of complex substances”
[3] El libro de Pauling titulado “La naturaleza del enlace químico” (The nature of chemical bond. Cornell University Press, 1960), se convirtió en la principal referencia sobre el tema.
[4] La hemoglobina humana tiene cuatro cadenas, (dos cadenas α y dos cadenas β) peptídicas unidas a un grupo hemo, no proteico.
Los aminoácidos unidos químicamente en una cadena reciben el nombre de péptidos. Se llama estructura primaria a la secuencia o lista ordenada de péptidos de una cadena peptídica.
Para el estudio del reloj evolutivo molecular interesan las cadenas peptídicas.
[5] J. D. Watson, A. Berry. ADN el secreto de la vida. 2003. Taurus. Pág. 243.
[6] Zuckerkandl, Emile, Richard T. Jones, and Linus Pauling. «A comparison of animal hemoglobins by tryptic peptide pattern analysis.» Proceedings of the National Academy of Sciences 46.10 (1960): 1349-1360.
[7] El trigo original, por ejemplo, tenía 7 pares de cromosomas, mientras que ahora se cultivan habitualmente trigos de 21 y 28 pares de cromosomas. En: Feldman, Moshe; Sears, Ernest R. Los recursos genéticos silvestres del trigo. Investigación y Ciencia, marzo de 1981. Pág. 50.
[8] Unidades que componen los ácidos nucleicos. Cada nucleótido de ADN está constituido por la unión química de una molécula de desoxirribosa, una molécula de fosfato y una base nitrogenada.
[9] Las mutaciones en las células somáticas no pasan a la siguiente generación, se pierden a la muerte del individuo.
[10] En la práctica es imposible que dos poblaciones completamente separadas acumulen exactamente las mismas mutaciones a lo largo del tiempo. El conjunto de mutaciones acumuladas por ambas poblaciones será con el paso del tiempo más y más diferente.
[11] Este proceso es conocido como especiación alopátrica. No es la única forma de creación de especies.
[12] Las mismas proteínas o proteínas equivalentes: que tienen un origen evolutivo común y realizan la misma función. Por ejemplo: la hemoglobina de la sangre de distintos animales.
[13] “The notion of a molecular evolutionary clock was therefore formulated by early 1961, although no formally explicated until 1965 in a paper by Zuckerkandl and Pauling”. Aunque Lewin establece el anuncio en el año 1951, (Lewin, Roger. Patterns in evolution: the new molecular view. New York: Scientific American Library), casi todas las referencias consultadas refieren que el anuncio apareció en el artículo: E. Zuckerkandl & L.B. Pauling (1962) Molecular disease, evolution, and genetic heterogeneity. In Horizons in Biochemistry, pp. 189-225.
[14] Según se supo más tarde, los cambios en la secuencia de nucleótidos de ADN a menudo no producen cambios inmediatos en la secuencia peptídica de la cadena que codifican. Por otro lado, el azar podría producir cambios que revirtieran cambios anteriores.
[15] Charles G. Sibley y Jon E. Ahlquist. Filogenia de las aves mediante comparación de ADN. Investigación y Ciencia. Abril 1986. Pág. 64.
[16] Kimura, Motoo. «Teoría neutralista de la evolución molecular.» Investigación y ciencia 40.180 (1980): 46-55.
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